BIOKIMIA
ACARA V
PENGUJIAN VISUALISASI ASAM DEOKSIRIBONUKLEAT
DNA
Disusun oleh :
Nama : Rr.Wulan Setyadewi
Nim : 06/194952/PN/10699
Gol : A2
Hari/tgl : Selasa /30 September 2007
Asisten : Ajeng Dara Pramita
LABORATORIUM BIOKIMIA
JURUSAN MIKROBIOLOGI PERTANIAN
FAKULTAS PERTANIAN
UNIVERSITAS GADJAH MADA
YOGYAKARTA
2007
ACARA V
VISUALISASI ASAM DEOKSIRIBONUKLEAT
(DNA)
I. DASAR TEORI
DNA merupakan gen itu sendiri, karena DNA merupakan pembawa sifat-sifat genetik yang khas dalam kromosom. DNA terdapat pada mitokondria, plastid, dan sentriol. Sedangkan rumus dari DNA adalah (Handayanto, 2000):
1. Merupakan susunan kimia makromolekul yang kompleks.
2. Molekulnya merupakan suatu rantai yang amat panjang.
3. Substansi dasarnya terdiri atas gula, fosfat + basa.
- Gugusan gula (pentosa yang disebut deoksiribosa).
- Asam Fosfat
- Basa Nitrogen (terikat pada setiap molekul gula).
Asam Deoksiribonukleat merupakan senyawa kimia yang paling penting pada makhluk hidup yang membawa keterangan genetik dari sel khususnya atau dari makhluk dalam keseluruhannya dari satu generasi ke generasi berikutnya. Semua makhluk hidup kecuali beberapa virus memiliki DNA. Di dalam sel, bagian terbesar dari DNA terdapat dalam nukleus, terutama dalm kromoso. Molekul DNA juga ditemukan didalam mitokondria, plastida, dan sentriol. Pada paramecium, tetrahymena, amoeba proteus, amphibia, dan paku-pakuan molekul ADN terdapat dalam dasar sitoplasma. (Suryo, 1998).
Kebanyakan DNA sel hewan ditemukan dalam inti, sedangkan kebanyakan RNA berada di sitoplasma. DNA inti adalah unsur pokok utama dari kromosom-kromosom dan terdapat dalam bentuk heliks ganda tipis dengan lebar hanya 2 mm. Heliks ganda terlipat dan berkompleks dengan protein membentuk untai kromosom dengan garis menengah kurang lebih 100 sampai 200 mm. Masing-masing kromosom mengandung duplet DNA tunggal. Kromosom mempunyai bermacam- macam ukuran, terkecil kromosom manusia mengandung kurang lebih 4,6.10 pasangan basa DNA dan yang terbesar adalah 2,4.10 pasangan basa. Hal ini dapat dilihat pada bakteri E. koli yang mempunyai 4,5.10 pasangan base ( Montgomery R, et al.,1983).
Watson dan Crick mengambil kesimpulan bahwa DNA berbentuk double helix yang terdiri dari 2 pita spiral yang saling berpilin. Di bagian luar terdapat deretan gula phospat (yang membentuk tulang punggung dari double helix). Di bagian dalam dari double helix terdapat basa purine dan pirimidin (Suryo, 1998).
DNA mempunyai struktur yang disebut struktur heliks ganda. Ciri-ciri penting dari struktur heliks ganda
DNA terdiri dari 2 rantai polinukleotida yang melingkar menurut satu sumbu heliks.
1. Kedua helix bersifat putar kanan dan arahnya berlawanan menurut ujung-ujung 3’ dan 5’nya.
2. Basa purinnya.
Baik DNA maupun RNA, keduanya mengandung basa purin adenine(A) dan guanin (G). DNA mengandung pirimidin timin (T) dan sitosin (S), sedangkan RNA mengandung sitosin (S) dan Urasil (U). DNA berdasarkan letaknya terbagi menjadi 2 yaitu DNA yang berada didalam kromosom (kromosom DNA) dan DNA yang berada di luar kromosom (ekstrakromosomal DNA). DNA yang berada di luar kromosom disebut DNA plasmid ini memiliki struktur linear maupun sirkuler. DNA mampu bermigrasi menuju kutub positif karena molekul DNA memiliki muatan / panjang yang konstan, disebabkan oleh muatan negatif pada muatan fosfat. Karena sifatnya tersebut, DNA dapat dipisahkan berdasarkan berat molekulnya dengan menggunakan metode elektroforesis. Faktor- faktor yang mempengaruhi laju DNA pada proses elektroforesis adalah ukuran pori gel agarosa, dan panjang DNA, konformasi DNA, dan volkase yang digunakan. Molekul DNA dapat dilihat dan ditentukan struktur molekul serta ukurannya dengan menggunakan tambahan metode elektroforesis, cahaya UV, dan pengecatan DNA dengan ethidium bromide. Ethidium bromida merupakan senyawa penginteraksi yang bila dikenai cahaya UV akan memendarkan cahaya oranye (Nur dan Adijuwanda, 1989)
Elektroforesis adalah perpindahan partikel-partikel bermuatan karena pengaruh medan listrik. Kegunaan elektroforesis antara lain menentukan berat molekul ( estimasi) dan mendeteksi terjadinya pemalsuan bahan dapat mendeteksi terjadinya kerusakan bahan seperti protein dalam pengolahan dan penyimpanan untuk memisahkan species molekul yang berbeda secara kualitatif dan kuantitatif yang selanjutnya masing-masing species yang dianalisis menetapkan titik isoelektrik protein. Waktu yang diperlukan untuk tercapainya pemisahan molekul yang optimum tergantung pada jenis molekul yang dipisahkan, serta buffer yang digunakan (Nur dan Adijuwanda, 1989).
Struktur berutas rangkap (DNA) dalam larutan dapat dilebur oleh kenaikan suhu atau penurunan konsentrasi garam. Tidak hanya dua kumpulan basa dijauhkan, tetapi basa-basa itu sendiri tidak tertumpuk sementara masih tetap dihubungkan dalam polimer oleh tulang punggung fosfodiester. Bersamaan dengan denaturasi molekul DNA ini adalah kenaikan daya serap optik basa purin dan pirimidin, peristiwa ini disebut tuperkromisitas dari denaturasi. Karena penumpukan molekul berutas rangkap DNA menunjukkan sifat suatu serabut dan dalam larutan merupakan suatu zat kental yang kehilangan viskositasnya pada denaturasi (Kimball, 1996).
II. TUJUAN
1. Mengetahui faktor-faktor yang mempengaruhi laju migrasi DNA.
2. Membedakan konformasi DNA dan ukurannya.
III. METODOLOGI
A. Alat dan Bahan
a. Alat :
• Tangki elektroforesis * White tip
• UV transluminator * cetakan + sisiran agarose
• Eppendorf * Parafilm
• Mikropipet (0,5µ-10µ) * Sarung tangan
b. Bahan :
• Aquades * Loading sample
• TAE * Ethidium bromida
*0,8% gel agarosa
B. CARA KERJA
1. Diencerkan buffer 10 X TAE menjadi buffer 1X TAE
2. Dilarutkan agarosa dalam buffer 1 X TAE ( 0,8 gr agarosa dalam 100 ml TAE) kemudian dipanaskan dengan micromave oven atau pemanas lainnya, dan pastikan semua agarosa larut .
3. Ditambahkan ethidium bromide pada larutan agarosa, dengan konsentrasi 0,5µg/ml.
4. Cetak gel agarosa dengan menggunakan cetakan khusus yang telah dipasangi sisir (comb) untuk membuat sumuran (well), kemudian biarkan terjadi polimerisasi (gel memadat).
5. Setelah gel memadat, masukkan gel ke dalam tanki elektroforesis, kemudian tuangkan buffer 1X TAE hingga gel terendam, lalu lepaskan sisir.
6. Masukkan 8µl sampel DNA yang telah dicampur loading buffer ke dalam sumuran gel.
7. Hubungkan tanki elektroforesis dengan sumber tegangan DC (awas jangan sampai terbalik dalam memasang kutub +/-)
8. Dibiarkan hingga DNA bermigrasi. Setelah jarak migrasi dianggap cukup. Matikan sumber tegangan dan selanjutnya amati pola migrasi DNA dengan menggunakan UV transiluminator dan tentukan / hitung jarak migrasi.
IV. HASIL dan PEMBAHASAN
PENGAMATAN
Hasil pengamatan terhadap DNA dengan menggunakan metode elektroforesis dan pengecatan dengan ethidium bromide dari cahaya ultraviolet dapat digunakan untuk melihat suatu molekul DNA, menentukan ukuran dan kondisi struktur molekulnya. Dari hasil pengamatan didapat dimana letak DNA sejajar ini berarti berat molekul pada DNA sama, semakin kecil berat molekul DNA migrasi paling cepat . Dari gambar garis yang menandakan DNA, garis yang tebal menandakan jumlah DNA lebih banyak, dimana semakin banyak warna orange makin pekat.
Suatu laju migrasi itu sendiri dipengaruhi oleh beberapa faktor yaitu ukuran pori gel agarosa dan panjang DNA, konformasi DNA, dan voltase yang digunakan. Ukuran pori gel agarosa akan mempengaruhi konsentrasi gel agarosa, bila konsentrasinya semakin tinggi, maka ukuran porinya akan semakin kecil sehingga mengakibatkan pori dari gel agarosa akan semakin sulit untuk dilewati karena ukurannya yang semakin sempit dan kecil. Dengan adanya perbedaan konsentrasi gel agarosa tersebut akan menyebabkan perbedaan ukuran pori gel agarosa yang berarti bahwa akan timbul suatu perbedaan ukuran jalan migrasi bagi DNA. Perbedaan ukuran jalan migrasi bagi DNA tersebut nantinya akan mempengaruhi lambat atau cepatnya DNA dalam bermigrasi. Semakin kecil konsentrasi, maka DNA akan melaju lebih cepat daripada DNA pada gel agarosa yang konsentrasinya lebih besar.
Selain itu, konformasi DNA juga mempengaruhi pola migrasi molekul DNA pada gel agarosa. Umumnya, pola migrasinya adalah supercoil > linear > open circular. DNA yang terbentuk supercoil akan lebih mudah untuk melaju cepat daripada dua bentuk lainnya. Hal ini dikarenakan DNA supercoil memiliki bentuk yang berpilin. Bentuk inilah yang memudahkan suatu DNA melaju lebih jauh. Sedangkan DNA dengan bentuk linear lebih lambat dibanding supercoil tetap lebih cepat bila dibandingkan dengan DNA yang circular, ini disebabkan bentuk linier ini sangat mudah menyesuaikan diri dengan jalan yang dilewatinya. Ini tentu berbeda dengan bentuk DNA open circular yang harus membutuhkan waktu yang cukup lama untuk memasuki / menyesuaikan dengan bentuk sumurannya.
Voltase mempengaruhi laju migrasi DNA. Semakin besar voltase yang digunakan, maka akan semakin cepat DNA yang melaju, dan semakin lama pula penggunaanya semakin cepat pula laju DNA-nya.
Jarak migrasi yang berbeda, selain dipengaruhi dipengaruhi oleh faktor-faktor migrasi diatas, dapat pula dipengaruhi oleh ukuran plasmid yang digunakan. Ukuran dari plasmid yang belum dipotong lebih besar daripada plasmid yang telah dipotong. Hal ini menyebabkan plasmid DNA yang telah terpotong akan melaju lebih cepat daripada plasmid yang belum terpotong. Cepat dan lambatnya laju migrasi inilah yang akan membuat jarak migrasi yang sangat berbeda-beda.
V. KESIMPULAN
1. Untuk melihat suatu molekul DNA menggunakan metode elektroforesis dan pengecatan dengan ethidium bromide dari cahaya ultraviolet.
2. Faktor yang mempengaruhi laju migrasi DNA adalah ukuran pori gel agarosa, konformasi DNA, panjang DNA, dan voltase yang digunakan.
3. Ukuran dan konformasi DNA menunjukkan ekspresivitas yang berbeda- beda.
4. pola migrasi molekul DNA pada gel azarosa adalah supercoil > linear > open circular
VI. DAFTAR PUSTAKA
Handayanto, R. 2000. Biologi. Erlangga : Jakarta.
Kimball, A.W. 1996. Biology. Erlangga : Jakarta.
Montgomery, R. Dryer, R.L, Conway, T.W dan Spektor, A.A. 1983.
Biochemistry. Mosby Company. St Louis.
Nur, M.A dan Adijuwana. 1989. Teknik Pemisahan dalam Analisis Biologis. IPB,
Bogor.
Suryo. 1998. Genetika. Universitas Gadjah Mada Press: Yogyakarta.
Yogyakarta, 30 September 2007
Asisten Praktikan
Ajeng Dara Pramita Rr.Wulan Setyadewi
